ACCT est un outil de comptage automatique de cellules rapide et accessible utilisant l'apprentissage automatique pour la segmentation d'images 2D

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8213 (2023) Citer cet article

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Le comptage des cellules est la pierre angulaire du suivi de la progression de la maladie en neurosciences. Une approche courante pour ce processus consiste à demander à des chercheurs formés de sélectionner et de compter individuellement les cellules dans une image, ce qui est non seulement difficile à standardiser, mais aussi très long. Bien qu'il existe des outils pour compter automatiquement les cellules dans les images, la précision et l'accessibilité de ces outils peuvent être améliorées. Ainsi, nous introduisons un nouvel outil ACCT : comptage automatique de cellules avec segmentation Weka formable qui permet un comptage automatique flexible des cellules via la segmentation d'objets après une formation pilotée par l'utilisateur. L'ACCT est démontré par une analyse comparative d'images de neurones accessibles au public et d'un ensemble de données interne de cellules microgliales colorées par immunofluorescence. À titre de comparaison, les deux ensembles de données ont été comptés manuellement pour démontrer l'applicabilité de l'ACCT en tant que moyen accessible pour quantifier automatiquement les cellules de manière précise sans avoir besoin de clusters informatiques ou de préparation avancée des données.

La quantification des cellules dans les images immunofluorescentes a longtemps été une étape limitante en temps et en efforts requis pour l'analyse des données de microscopie utilisées dans la recherche. Ces techniques d'analyse d'images sélectives peuvent fournir des informations physiologiques précieuses et les comptages manuels par des professionnels formés ont été considérés comme la « norme de référence » pour la quantification1,2.

Ici, nous avons utilisé des comptages manuels complets de plusieurs observateurs séparés pour la comparaison avec une méthodologie de comptage automatique des cellules. Traditionnellement, un aspect important du maintien de la cohérence dans la quantification des cellules a été de s'assurer qu'un ensemble de données est compté par un seul observateur qui s'efforce d'exactitude et de reproductibilité tout en étant idéalement aveuglé par les conditions expérimentales. Cela limite massivement la vitesse à laquelle les données de comptage de cellules peuvent être traitées, car l'augmentation de la main-d'œuvre ne se traduit pas toujours par une vitesse accrue. Le comptage manuel peut avoir des problèmes de reproductibilité et de cohérence dans un ensemble de données en raison de l'erreur humaine et de la fatigue. De tels problèmes peuvent être évités en utilisant des modèles de calcul qui restent cohérents sur un nombre quelconque d'images.

À cette fin, nous introduisons ici ACCT : Automatic Cell Counting with Trainable Weka Segmentation (TWS) hébergé sur GitHub à l'adresse https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git. TWS fournit une base d'apprentissage automatique pour notre méthodologie de comptage automatique de cellules accessible, avec un potentiel de traitement d'image supplémentaire fourni par des scripts dans ImageJ, Python et BeanShell3,4. Le programme TWS fournit une interface utilisateur graphique (GUI) pour la formation et l'application d'un classificateur d'apprentissage automatique qui différencie les pixels cellulaires et non cellulaires, qui sont ensuite regroupés en objets cellulaires et comptés. L'ACCT est construit autour de cette segmentation de pixels pour fournir une validation quantitative au niveau cellulaire et aider à la sélection et à l'application optimales du classificateur (Fig. 1). L'ACCT traite les images monocanal fournies par les utilisateurs. Les images avec plusieurs canaux peuvent être analysées à l'aide de copies d'images montrant un canal à la fois et en traitant des ensembles d'images pour chaque canal séparément.

Deux ensembles de données sont utilisés dans cette étude pour démontrer les performances dans des contextes d'imagerie variés. Le premier ensemble de données utilisé est composé de microglies imagées chez des souris avec et sans conditions d'activation de l'immunité et de l'inflammation provoquées par l'expression transgénique de la protéine d'enveloppe gp120 du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1)5. Ce modèle de NeuroHIV (souris HIVgp120tg) fournit un résultat observable à partir des comptages manuels, une augmentation de la microglie en présence de HIVgp120 (ci-après dénommée Activée) par rapport à l'absence de la protéine virale (contrôle non transgénique de la même portée, dénommé Repos). L'ACCT a été utilisé pour évaluer la différence de nombre de cellules microgliales à partir d'images représentées à la Fig. 2. Pour qu'une méthodologie de comptage automatique soit efficace dans un contexte expérimental, elle doit pouvoir s'adapter à la variabilité de la présentation des données résultant des conditions expérimentales6. La microglie est connue pour subir des changements morphologiques lors de l'activation qui modifient leur morphologie et leur apparence lorsqu'elles sont imagées par coloration immunofluorescente7,8. Nous nous concentrons sur un ensemble de données d'images de cellules marquées par immunofluorescence pour la protéine adaptatrice de liaison au calcium ionisée-1 (Iba-1), qui est un marqueur spécifique au type de cellule et permet de visualiser la microglie. Cependant, la méthodologie et les scripts d'accompagnement permettent une quantification automatique des cellules dans un large éventail de contextes d'imagerie.

Le deuxième ensemble de données utilisé est un ensemble d'images accessible au public de neurones colorés par un traceur rétrograde monosynaptique à un grossissement de 200x (Fig. 3). Cet ensemble de données, que nous appelons l'ensemble de données Fluocell, a été utilisé dans la génération de nouveaux ajouts au réseau de neurones U-net pour la segmentation cellulaire9,10. Ainsi, notre étude teste la validité de l'ACCT par rapport à un autre ensemble de données publié.

L'existence d'outils logiciels destinés aux sciences de la vie n'entraîne pas intrinsèquement une amélioration de la fonction11. Les connaissances techniques préalables à l'utilisation efficace de nouveaux outils logiciels peuvent créer des obstacles aux nouvelles méthodologies en raison de leur accessibilité. L'objectif de l'ACCT est de réduire la barrière à l'entrée pour l'exécution d'études d'imagerie semi-supervisées complètes. L'ACCT fournit les outils permettant de tirer parti de l'expertise des utilisateurs dans la fabrication artisanale de données de formation, tout en fournissant des outils quantitatifs pour évaluer efficacement la précision de la formation à partir d'une variété d'approches. En réduisant les connaissances en programmation requises des utilisateurs avec des éléments d'interface graphique, ACCT augmente l'accessibilité du comptage automatique des cellules. De plus, ACCT effectue une analyse statistique à partir des images comptées, réduisant la charge de travail technique et augmentant en outre l'accessibilité de l'outil.

Il existe de nombreuses façons de résoudre un problème de segmentation d'image. Ce problème complexe consiste à attribuer une étiquette appropriée à chaque pixel d'une image. Le programme TWS que nous utilisons n'est qu'un des nombreux outils logiciels, y compris les implémentations d'apprentissage automatique telles que Ilastik12 et les réseaux de neurones comme U-Net, ResUNet et c-ResUnet9,13,14.

Nous avons choisi de travailler avec TWS4 plutôt qu'Ilastik12 en raison de l'étendue accrue des fonctionnalités disponibles par défaut, ainsi que de l'intégration avec Fiji et ImageJ qui rationalise le traitement et l'analyse automatisés des images. Cette intégration avec ImageJ a rendu TWS plus accessible sur lequel s'appuyer pour cet outil d'imagerie automatique et les futurs.

Alors que des programmes comme TWS et Ilastik fournissent une excellente segmentation des pixels avec une interface accessible, il est également nécessaire d'évaluer la précision et les performances au niveau de la cellule, plutôt qu'au niveau du pixel. ACCT fournit un cadre permettant aux utilisateurs d'accomplir cela avec un minimum de manipulation de fichiers sur la ligne de commande. La segmentation d'Ilastik ne teste pas les modèles par rapport à une étape de validation après la formation de leur modèle d'apprentissage automatique, ce qui augmente le risque de surajustement à l'ensemble de données de formation. Ainsi, nous comparons les performances d'Ilastik à l'ACCT dans notre étude.

De plus, nous comparons les performances d'ACCT à celles de CellProfiler, un outil couramment utilisé pour l'analyse d'images qui permet aux utilisateurs de créer des pipelines modulaires15. Cet outil fournit une segmentation au niveau des pixels, bien qu'il ne fournisse pas de comptage automatisé des cellules avec des modèles d'apprentissage automatique sans son outil compagnon CellProfiler Analyst16. Cependant, CellProfiler Analyst nécessite que les utilisateurs modifient manuellement les fichiers texte et de base de données en SQL, ce qui nécessite une connaissance des éditeurs de code. Pour cette raison, nous ne comparons pas avec CellProfiler Analyst.

Enfin, ResUNet est une approche de réseau neuronal convolutif (CNN) pour la segmentation d'images et existe en tant qu'outil général pour l'étiquetage d'images. Il a été démontré qu'il utilise efficacement les données d'entraînement pour effectuer une segmentation cellulaire précise sur des images avec une grande variance dans le nombre de cellules, ainsi que la présence d'artefacts non cellulaires. Il s'agit d'un développement sur U-Net, qui s'est avéré efficace pour les tâches de comptage de cellules en vrac dans une variété de contextes. De plus, c-ResUnet est une extension de ResUNet9. Cependant, les modèles CNN nécessitent une puissance de traitement élevée pour générer des résultats dans un délai raisonnable, ce qui peut nécessiter l'accès à des centres de calcul coûteux. L'ACCT est conçu pour fonctionner efficacement sur les ordinateurs portables et les ordinateurs grand public disponibles dans le commerce.

Un aperçu visuel des composants et du processus de l'ACCT. (A) Weka et un ensemble d'images de formation sont utilisés pour créer plusieurs classificateurs grâce à une formation itérative. (B) Ces classificateurs sont ensuite évalués en masse par rapport aux images de validation et le meilleur classificateur est choisi par l'utilisateur. (C) Le classificateur choisi est appliqué à l'ensemble de données expérimental pour la quantification cellulaire, produisant un ensemble d'images comptées et le nombre de cellules dans chaque image, ainsi que des informations sur la morphologie cellulaire. Ces informations incluent la zone, la position, l'intensité minimale et maximale, la circularité, l'inclinaison et plus de détails sur chaque cellule, disponibles sur GitHub dans la section de disponibilité des données.

Un ensemble de données composé d'images de cellules microgliales positives pour Iba-1 a été généré selon les procédures récemment publiées par notre groupe17. En bref, l'ensemble de données a été dérivé de coupes cérébrales d'un modèle de lésion cérébrale induite par le VIH (HIVgp120tg), qui exprime la protéine d'enveloppe gp120 soluble dans les astrocytes sous le contrôle d'un promoteur GFAP modifié5. Les souris étaient dans un fond génétique mixte C57BL/6.129/SJL, et deux génotypes de souris mâles âgées de 9 mois ont été sélectionnés : les témoins de type sauvage (au repos, n = 3) et les compagnons de portée transgéniques (HIVgp120tg, activé, n = 3). Aucune randomisation n'a été réalisée. Les souris HIVgp120tg présentent, entre autres caractéristiques de la neuropathologie du VIH humain, une augmentation du nombre de microglies qui indique l'activation des cellules par rapport aux témoins non transgéniques de la même portée17. Toutes les procédures et tous les protocoles expérimentaux impliquant des animaux ont été réalisés conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et approuvés par les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute (SBP), du Scripps Research Institute (TSRI) et de l'Université de Californie Riverside (UCR). L'étude suit les directives ARRIVE.

Les procédures de prélèvement de tissu cérébral, de coloration par immunofluorescence et de microscopie de la microglie ont été décrites dans une publication récente de notre groupe17. En bref, les souris ont été anesthésiées en phase terminale avec de l'isoflurane et perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline \(0,9\%\). Les cerveaux de souris ont été prélevés et fixés pendant 72 heures à \(4^{\circ }\hbox {C}\) dans du \(4\%\) paraformaldéhyde17. Des coupes de cerveau ont été obtenues à l'aide d'un vibratome (Leica VT1000S, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) et du cortex cérébral dans 40 \(\upmu \hbox {m}\) coupes sagittales épaisses espacées de 320 \(\upmu \hbox {m}\) médiale à latérale des cerveaux de chaque génotype. La coloration a été réalisée avec la molécule d'adaptateur de liaison au calcium anti-ionisée de lapin 1 (Iba-1) IgG (1: 125; Wako) avec l'anticorps secondaire isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Pour la quantification de la microglie colorée Iba-1, les corps cellulaires ont été comptés dans le cortex cérébral à partir de trois champs de vision pour trois sections chacune par animal. Entre 2 et 3 images ont été collectées par champ de vision pour capturer autant de cellules que possible avec une mise au point suffisante pour l'identification. La microscopie a été réalisée avec un microscope à déconvolution de fluorescence Zeiss 200 M avec une platine 3D contrôlée par ordinateur et un filtre FITC. Toutes les images ont été collectées à l'aide du logiciel Slidebook (version 6, Intelligent Imaging Innovations, Inc., Denver, CO). Les images ont été acquises à un grossissement de 10X et une résolution de pixels de 1280x1280 et recadrées à une zone de 1280x733 pixels pour exclure les bords irréguliers des tissus. Des exemples représentatifs sont illustrés à la Fig. 2.

Images de microglie marquée par immunofluorescence avant et après segmentation. Un exemple d'images appariées traitées de la microglie immunomarquée Iba-1 dans le cortex cérébral (couche III ; panneau supérieur) de souris de type sauvage, non transgéniques (« au repos ») et de souris HIVgp120tg (« activées »), et les images de segmentation finales associées générées via ACCT (panneau inférieur). Les segmentations d'objets résultantes sont codées par couleur (bleu = vrai positif, rouge = faux positif, jaune = faux négatif). Les objets segmentés à partir d'images dans le même champ de vision ont été projetés avec une taille d'exclusion minimale de 50 pixels pour le comptage. La coloration par immunofluorescence et l'acquisition d'images sont décrites dans des publications antérieures et dans la section Méthodes17. Barre d'échelle : 100 \(\mu m\).

Les comptages manuels ont été effectués par trois observateurs, qui ont été autorisés à ajuster la luminosité de l'image pour faciliter au mieux la précision du comptage. Les images ont été collectées sous la forme d'une pile Z composée de deux à trois plans de mise au point distants de 0, 5 \ (\ upmu \ hbox {m} \) par champ afin de permettre à l'observateur de confirmer la présence de corps cellulaires positifs Iba-1 qui n'étaient que partiellement mis au point. Le plan montrant la plupart des cellules mises au point a été utilisé comme plan principal pour le comptage. Les observateurs ont utilisé différents logiciels de visualisation lors du comptage. L'observateur A a utilisé le logiciel Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO) associé au microscope et les observateurs B et C ont utilisé la distribution Fidji d'ImageJ 2.1.0 pour le comptage manuel. De plus, le comptage de l'observateur A a été effectué avant le début de ce projet, et des marqueurs de comptage ont été placés sur des images à proximité des corps cellulaires pour une sommation totale rapide. Les observateurs B et C ont placé des comptages dans les corps cellulaires pour permettre une évaluation ultérieure de la précision au niveau de la cellule. Les nombres de microglies ont été normalisés à la zone dans les cas où une partie de la zone d'image ne convenait pas à la détection des cellules, en raison de lésions tissulaires ou d'une irrégularité d'épaisseur (n = 3 images sur 62 au total dans l'étude).

Image de neurones marqués par fluorescence avant et après segmentation. Une image recadrée tirée de l'ensemble de données Fluocell associée à la segmentation cellulaire (a). Cela représente des objets cellulaires segmentés à partir de l'image \(\hbox {MAR38S1C3R1}\_\hbox {DMR}\_20\_\hbox {o}\) rapporté dans l'ensemble de données Fluocell accessible au public segmenté par c-ResUnet10 (b) et ACCT avec classifierBayes3 (c). Les segmentations d'objets résultantes sont codées par couleur (bleu = vrai positif, rouge = faux positif, jaune = faux négatif). L'ACCT a été configuré pour filtrer les objets inférieurs à 250 pixels et supérieurs à 5000 pixels pour supprimer le bruit. Nous avons appliqué l'algorithme du bassin versant à cet ensemble de données. L'ACCT a correctement identifié 84,6 % du nombre de mains dans cette image et c-ResUnet 86,2 %, tandis que l'ACCT était correct avec 86,9 % de toutes les prédictions et c-ResUnet avec 93,3 %. Barre d'échelle : 50 \(\mu m\).

Pour examiner et développer plus avant l'efficacité de l'ACCT sur une variété de données, nous avons également effectué une étude de comptage de cellules à l'aide d'un ensemble d'images accessible au public9,10. Les 283 images de 1600 x 1200 pixels ont été prises à un grossissement de 200x de 35 \(\upmu \hbox {m}\) tranches épaisses de tissu cérébral de souris avec des neurones colorés via un traceur monosynaptique rétrograde (Cholera Toxin b, CTb). Ce traceur a mis en évidence uniquement les neurones connectés au site d'injection de la toxine.

Cet ensemble de données contient des images avec une densité cellulaire élevée et faible, ainsi que des quantités variables de bruit et d'artefacts (Fig. S2 supplémentaire). Nous avons également observé que de nombreuses images contiennent des cellules qui se chevauchent ou se touchent. L'ensemble de données Fluocell présente des défis différents par rapport à notre ensemble de données sur la microglie positive Iba-1 où les cellules sont réparties plus uniformément et le nombre de cellules par image est plus cohérent. Un exemple représentatif des données Fluocell est illustré à la Fig. 3.

Dans l'analyse Fluocell de ces données, un sous-ensemble d'images a été compté manuellement par les auteurs, et les images restantes ont été comptées via un seuillage automatique9. Étant donné que nous souhaitons comparer l'ACCT au nombre de cellules humaines placées en tant qu'étiquettes de vérité au sol pour évaluer les performances de notre outil par rapport au comptage de cellules humaines, nous avons compté manuellement l'ensemble des 283 données d'images (un observateur). Cela nous permet de valider notre outil par rapport au comptage manuel des cellules d'observation plutôt qu'à un autre processus automatique. De plus, les auteurs de l'ensemble de données Fluocell ont écrit leur propre programme de comptage cellulaire automatisé en utilisant une approche CNN nommée c-ResUnet qui s'appuie sur ResUNet9. Ainsi, nous comparons également les performances de l'ACCT par rapport à c-ResUnet et Ilastik sur l'ensemble de données Fluocell avec nos comptages manuels. Nous reconnaissons qu'il est possible de générer de meilleurs classificateurs pour Ilastik et CellProfiler pour notre ensemble de données, mais nous maintenons que ces programmes ne disposent pas de la fonctionnalité permettant aux utilisateurs de générer et d'évaluer plusieurs classificateurs à grande échelle. Par conséquent, nous avons généré moins de classificateurs pour ces programmes et sélectionné le classificateur optimal lors de la formation.

L'ACCT est open source, disponible sur GitHub à l'adresse https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git. Notre classificateur d'apprentissage automatique a été construit à l'aide du plug-in TWS version 3.2.34 dans ImageJ 2.1.0 inclus dans la distribution Fiji18. De plus, les packages Python open source : scipy, pandas, numpy, matplotlib, imageio et scikit-learn ont été utilisés dans ACCT19,20,21,22,23,24.

L'ACCT permet de sélectionner plusieurs types d'approches d'apprentissage automatique. L'apprentissage automatique fait ici référence à des modèles dynamiques formés sur des données d'entrée spécifiées par l'utilisateur pour sélectionner des pixels de cellule dans une image. Les utilisateurs peuvent également télécharger des approches d'apprentissage automatique supplémentaires compatibles avec Weka si vous le souhaitez. Pour cet article, nous utilisons une implémentation de l'approche Random Forest, appelée Fast Random Forest4,25. Il s'agit de l'approche d'apprentissage automatique par défaut dans TWS et les fonctionnalités par défaut suivantes ont été utilisées :

flou gaussien

Filtre Sobel

Toile de jute

Différence de Gaussienne

Projections membranaires

Épaisseur de membrane = 1

Taille du patch membranaire = 19

Sigma minimal = 1,0

Sigma maximal = 16,0

Nous utilisons en outre un modèle de réseau bayésien, qui est également implémenté dans Weka4. Cette approche, appelée BayesNet, suit un modèle statistique bayésien pour déterminer la probabilité que les caractéristiques observées soient conditionnellement dépendantes ou causées par l'objet d'intérêt26. Pour cette étude, nous utilisons les paramètres suivants pour la classification bayésienne des pixels, en plus des fonctionnalités énumérées ci-dessus :

Variance

Moyenne

Le minimum

Maximum

Médian

Diffusion anisotrope

Bilatéral

Lipschitz

Kuwahara

Gabor

Entropie

Voisins

Lors de la détection des cellules, les processus ou artefacts cellulaires petits et grands peuvent être classés comme des corps cellulaires ayant une apparence suffisamment similaire aux cellules. Nous traitons ce bruit en implémentant un paramètre de taille d'objet de cellule minimale et maximale lors du comptage des cellules. Ainsi, les objets en dehors de la plage de taille spécifiée sont exclus du comptage automatique. Cette plage est déterminée empiriquement par les corps cellulaires observés lors de la formation et de la validation du modèle.

Un défi supplémentaire pour la détection des cellules est lorsque deux cellules ou plus sont contiguës ou se chevauchent. Cela entraîne l'identification de plusieurs cellules comme une seule grande cellule, donc l'ACCT doit séparer ces objets pour augmenter la précision. Ainsi, nous activons éventuellement un algorithme de bassin versant après la segmentation des pixels27. Cet algorithme est utilisé pour séparer les objets par contour, ce qui permet de compter indépendamment les objets séparés. Nous utilisons l'implémentation par défaut de l'algorithme de bassin versant fourni dans ImageJ27. Nous avons utilisé la stratégie de segmentation des bassins versants dans l'ensemble de données Fluocell qui avait des cellules étroitement groupées, et avons comparé les performances de l'ACCT avec et sans bassin versant pour démontrer l'effet de l'algorithme dans la Fig. S3 supplémentaire.

Les modèles d'apprentissage automatique dans TWS génèrent une carte de probabilité pour chaque image qui est une représentation de chaque pixel de l'image comme la probabilité qu'il fasse partie d'un objet d'intérêt. Cette probabilité est comparée à un seuil de confiance, qui est la probabilité minimale qu'un pixel doit avoir pour être considéré comme faisant partie d'un objet. L'utilisateur peut définir différentes valeurs de seuil, ce qui affecte le degré de prudence ou de libéralité du programme dans l'identification des objets. Par défaut, ACCT démarre à un seuil de 0,5 qui peut être modifié par les utilisateurs via l'interface utilisateur. Classiquement, des seuils plus stricts conduisent à moins de faux positifs mais aussi à moins de vrais positifs. L'inverse est également vrai avec un seuil plus souple identifiant plus de vrais positifs, mais aussi plus de faux positifs. Les performances de l'ACCT à différents seuils sont représentées visuellement sur une courbe ROC (Receiver Operator Characteristic). Cependant, certains modèles utilisables avec TWS dans ACCT ne donnent qu'un zéro binaire ou un pour leurs valeurs de confiance, ce qui empêche la génération de courbes ROC significatives.

La formation sur l'ensemble de données de microglie Iba-1 a été tirée de 10 images sélectionnées au hasard non utilisées dans l'analyse de comptage. Ces images ont été collectées à l'aide des méthodes décrites ci-dessus à partir de souris réparties également entre les génotypes expérimentaux (Fig. 2). Nous notons que l'ACCT est actuellement capable de gérer uniquement des images monocanal, plutôt que des images multicanaux. Des ajustements incrémentiels aux données d'entraînement et à la classification changeante des pixels qui en résultent ont été observés en temps réel et les classificateurs ont été enregistrés de manière séquentielle.

Pour éviter le surentraînement, les classificateurs sont mis à jour quelques pixels à la fois avec de nouvelles données d'entraînement et les segmentations de pixels mises à jour sur les données d'entraînement sont immédiatement observées dans TWS. Des données d'apprentissage ultérieures sont sélectionnées pour traiter les zones de segmentation incorrecte. Nous continuons cela sur des itérations successives de classificateurs, en sauvegardant une version du classificateur après chaque ajout de données d'apprentissage. Ce schéma de création de classificateur itératif se poursuit jusqu'à ce que le classificateur ne semble pas améliorer les données. L'ACCT effectue ensuite une évaluation de la précision des données de validation et des marqueurs de vérité terrain, en tenant compte des conditions expérimentales, pour aider l'utilisateur à sélectionner l'itération de classificateur avec la plus grande précision et cohérence dans l'ensemble de données de validation.

Cette stratégie a été appliquée pour créer plusieurs classificateurs séquentiels qui ont ensuite été appliqués à l'ensemble de données de validation (Fig. 1, Fig. S1 supplémentaire). En fin de compte, 25 classificateurs séquentiels ont été formés sur les données de la microglie Iba-1. L'ensemble de données de validation de la microglie Iba-1 était composé de 10 images (Repos n = 5, Activé n = 5) de l'ensemble de données principal qui a ensuite été exclu de toutes les analyses ultérieures. Des marqueurs de comptage spécifiques à l'emplacement du corps cellulaire ont été placés dans ces images par l'observateur B, et les performances ont été calculées via la précision, le rappel, le score F1, l'exactitude, ainsi qu'un test T d'étudiant de précision différentielle entre les images au repos et activées. L'ACCT est également capable d'effectuer des calculs ANOVA pour d'autres analyses incluant plus de deux groupes expérimentaux.

Dans les données Fluocell, 10 images d'entraînement ont été sélectionnées dans l'ensemble de données pour représenter la variété des défis de segmentation au sein de l'ensemble de données : intensité très variable, densité cellulaire très variable, images cellulaires qui se chevauchent et images avec des artefacts non cellulaires. L'ensemble de données de validation a été créé avec un ensemble différent de 10 images sélectionnées pour représenter une distribution similaire de défis.

Les vrais scores positifs pour chaque image sont déterminés par la localisation de marqueurs de comptage manuel qui sont vérifiés par rapport aux valeurs d'emplacement de pixel de chaque objet pour le processus de comptage automatique. Les faux positifs pour chaque image sont représentés par le nombre total d'objets de cellule générés automatiquement qui ne contiennent pas un seul décompte manuel. Les faux négatifs pour chaque image sont déterminés par le nombre total de marqueurs de comptage manuel qui ne sont pas contenus à l'intérieur d'un objet généré automatiquement par le programme, plus le nombre de marqueurs de comptage manuel à l'intérieur d'un objet de cellule unique supérieur à un, indiquant une séparation d'objet insuffisante. Comme nous évaluons la précision en fonction de l'emplacement des cellules et ne différencions pas les pixels d'arrière-plan, l'ACCT n'inclut pas la détermination des emplacements des cellules vraiment négatives. Cette méthodologie a été utilisée dans Morelli et al.9, et nous calculons la précision comme \(\frac{TP}{TP + FP + FN}.\)

Nous évaluons les performances de nos classificateurs à l'aide de mesures de précision, de rappel, de score F1 et d'exactitude. La précision est la proportion de comptages automatiques qui sont corrects sur la base de marqueurs placés manuellement, et le rappel est la proportion du nombre total de marqueurs de cellules placés manuellement qui ont été identifiés avec succès par le comptage automatique. Le score F1 est la moyenne harmonique de la précision et du rappel. La précision est évaluée spécifiquement comme le nombre de vrais comptages de cellules positifs en proportion de tous les comptages manuels et automatiques, y compris les faux négatifs. Plusieurs classificateurs peuvent être évalués grâce à une analyse statistique calculée automatiquement. Des mesures statistiques, telles que l'erreur absolue moyenne (MAE), sont en outre calculées via l'ACCT pour évaluer les performances de différents classificateurs. Nous avons utilisé ces statistiques pour évaluer les performances de l'ACCT par rapport à d'autres outils de comptage automatique de cellules basés sur ces mesures.

Ces informations statistiques sont présentées dans les Fig. 4 et 9. La figure 4 est un sous-ensemble des données complètes qui se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. La figure 9 montre des statistiques de précision sélectionnées à différents seuils de confiance. La sélection du classificateur via le meilleur score F1 ou une pondération différente de la précision et du rappel sont toutes des mesures valides pour sélectionner un classificateur. Cependant, pour cette étude, nous avons sélectionné le classificateur basé sur le score F1 le plus élevé.

Résumé des performances du classificateur individuel sur l'ensemble de données de la microglie Iba-1 pendant la phase de validation. Un graphique des trois classificateurs formés de manière incrémentale les plus et les moins précis, classés par score F1 de 25 classificateurs formés (n = 10 images). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne sur les statistiques de performances calculées à partir de chaque image, où la statistique elle-même est calculée à partir du nombre total de cellules dans l'ensemble de données. Les paramètres utilisés dans ACCT : seuil de 0,5, taille de pixel minimale de 50 et taille de pixel maximale de 1 000.

À l'étape suivante, le classificateur sélectionné est appliqué à l'ensemble de données expérimental d'images. Cet ensemble de données expérimental exclut les images utilisées dans la formation et la validation. La méthodologie de comptage automatisé est répétée dans cette analyse et rapporte le nombre total de cellules comptées en plus d'autres informations statistiques par image. Des informations morphologiques sur chaque cellule identifiée sont rapportées par l'ACCT aux utilisateurs. Un exemple de ceci peut être trouvé dans le tableau supplémentaire 2, qui répertorie certaines des informations morphologiques rapportées générées à partir de l'analyse.

Nous avons en outre la possibilité pour les utilisateurs d'auditer les performances de leur classificateur sélectionné. L'audit nécessite un comptage manuel supplémentaire et est identique à la façon dont nous évaluons les performances des classificateurs lors de la phase de validation. Cette étape vise à déterminer dans quelle mesure le classificateur s'est comporté de manière similaire sur l'ensemble de données expérimental par rapport à l'ensemble de validation dans des situations où toutes les images n'ont pas été comptées manuellement. L'audit peut être effectué à l'aide d'un sous-ensemble de l'ensemble de données expérimental, voire de l'ensemble de données complet, si l'utilisateur choisit d'effectuer un comptage manuel complet pour évaluer la précision du modèle. Ces images sont connues sous le nom d'ensemble d'audit. Nous avons sélectionné au hasard 5 images chacune des images expérimentales de la microglie activée et au repos pour l'ensemble d'audit Iba-1. Un audit des données Fluocell a été réalisé sur un échantillon de 10 images du jeu de données expérimentales Fluocell (Fig. 5).

Tous les tests statistiques sur les images de la microglie Iba-1 incluent toutes les images sauf celles utilisées pour la formation et la validation (Repos n = 22, Activé n = 20). Nous signalons le décompte automatique du classificateur 10 au lieu du classificateur 4, car le classificateur 10 a fourni les performances maximales sur l'ensemble de données expérimental et l'ensemble d'audit que nous avons observés. L'augmentation significative de la densité de la microglie dans les images de souris gp120 positives (activées) était cohérente dans l'ensemble de données via une ANOVA à deux voies (\(\hbox {p} = 3,39E^{-16}\); Repos n = 22, Activé n = 20) (Fig. 6).

En tenant compte de la variance du génotype dans l'ensemble de données, aucune différence significative n'a été trouvée entre le nombre d'ACCT et les observateurs (Observateur A p = 0,060 ; Observateur B p = 0,514 ; Observateur C p = 0,440). De plus, la densité de microglie par image a démontré des corrélations significatives entre le comptage automatique et tous les observateurs avec des corrélations plus fortes dans les images de microglie au repos (Fig. 5).

Ce qui suit représente le nombre total de cellules :

Validation : Observer A/B 1263/1380 cellules sur 10 images.

Ensemble de données expérimentales : Observateur A/B/C 5158/5035/5056 cellules sur 42 images.

Ensemble d'audit : Observateur A/B/C 1239/1207/1262 cellules sur 10 images.

Analyse de corrélation des diagrammes de dispersion de la densité microgliale avec des lignes de régression pour toutes les comparaisons corrélatives entre les décomptes d'observateurs et le décompte automatique du classificateur 10 pour l'ensemble de données expérimental. Toutes les relations ont montré des corrélations globales positives significatives (p et Adj. \(R^{2}\) = valeurs incluses dans les figures ; \(\hbox {n}=42\)).

Densité moyenne de la microglie par génotype expérimental dans les comptages manuels et automatisés. Toutes les méthodes de comptage ont trouvé une augmentation de la densité de la microglie dans les images de la microglie activée par ANOVA à deux voies avec effet d'interaction et analyse post-hoc Tukey HSD. La différence entre la méthode de comptage et l'effet d'interaction n'a pas montré de signification statistique. (Génotype : p = \(3.39E^{-16}\ ); Méthode de comptage : p = 0,096 ; Génotype : Méthode de comptage : p = 0,224 ; Repos n = 22, Activé n = 20). Il n'y avait pas de différences significatives entre le comptage automatique et les observateurs B et C. Cependant, la densité du comptage ACCT avait globalement tendance à être inférieure à celle de l'observateur A (p = 0,0599 ; Repos n = 22, Activé n = 20). Cela suggère que le classificateur 10 peut avoir exclu certaines cellules légèrement colorées ou mal mises au point dans les images du groupe au repos que l'observateur A a comptées. Les barres d'erreur représentent l'écart type.

La précision globale et le rappel obtenus par la méthodologie TWS étaient similaires dans l'ensemble de données de validation, l'ensemble de données expérimentales et l'ensemble de données d'audit avec une précision globale et F1 a augmenté dans l'ensemble de données expérimental par rapport à la validation, comme indiqué pour le classificateur 10 à la Fig. 7). Par rapport à Ilastik et CellProfiler, ACCT avait des performances similaires et légèrement supérieures à celles des deux outils dans chaque ensemble d'images Iba-1, Ilastik surpassant légèrement CellProfiler. Nous avons également comparé ces outils aux fonctionnalités de base que les utilisateurs peuvent sélectionner manuellement à Fidji, pour illustrer comment l'ACCT s'appuie sur les fonctionnalités existantes de Fidji. Nous avons utilisé l'arrière-plan de soustraction avec une boule roulante, ajusté les outils de seuil aux Fidji pour cette analyse, avec une soustraction d'arrière-plan à une zone de 25 pixels et un seuil d'intensité de pixel de 90. Sans appliquer la taille minimale et maximale de l'objet, cette analyse a abouti à une précision proche de 0, nous avons donc utilisé une taille de pixel minimale de 50 et maximale de 1000 comme dans les autres outils. Le classificateur 10 surpasse les outils de base des Fidji dans la plupart des mesures, à l'exception de la précision. L'application Fidji de base surpasse également de peu Ilastik et CellProfiler dans la plupart des métriques des images Iba-1.

ACCT vs Ilastik vs CellProfiler vs Basic Fiji sur des images de microglie positive Iba-1. Les performances du classificateur ACCT 10 par rapport à Ilastik, CellProfiler et l'utilisation de base des outils Fiji. L'ensemble d'audit est une sélection de 10 images, qui est égale à la taille de l'ensemble d'images de validation, choisies dans l'ensemble de données expérimentales et réparties uniformément entre les groupes expérimentaux. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne sur les statistiques de performances calculées à partir de chaque image, où la statistique elle-même est calculée à partir du nombre total de cellules dans l'ensemble de données. Les paramètres utilisés par l'ACCT dans cette analyse étaient : un seuil de 0,5, une taille minimale de 50 pixels, une taille maximale de 1 000 pixels pour les objets.

Contrairement à l'ensemble de données sur la microglie Iba-1, l'ensemble de données Fluocell ne compare pas deux conditions expérimentales différentes. Tous les tests statistiques Fluocell incluent toutes les images Fluocell à l'exception de celles utilisées pour la formation et la validation (n = 263). Dans la Fig. 8, nous avons comparé les performances des modèles Fast Random Forest et BayesNet mis en œuvre dans l'ACCT par rapport à c-ResUnet, Ilastik et l'utilisation de base des Fidji9,12. La figure 8 montre que ClassifierRandomForest3 surpasse BayesNet sur la plupart des métriques statistiques. De plus, le modèle c-ResUnet a surpassé la plupart des métriques par rapport à ces deux classificateurs. Contrairement aux autres outils, Ilastik a un rappel beaucoup plus élevé que la précision dans les ensembles de données expérimentales et d'audit, ACCT et c-ResUnet étant plus performants en termes de précision. Cependant, Ilastik a le meilleur score F1 dans l'ensemble de données expérimental. La méthodologie de base des Fidji a eu des difficultés à peu près de la même manière que les autres classificateurs, avec une précision plus élevée et un faible rappel, elle a fourni une précision comparable aux classificateurs ACCT sur l'ensemble de données expérimental. Pour les Fidji de base, nous avons utilisé la soustraction de fond à une zone de 50 pixels et un seuil d'intensité de pixels de 70. Dans le contexte de cet ensemble de données, ce qui suit représente le nombre total de cellules :

Validation : 137 cellules sur 10 images.

Ensemble de données expérimentale : 3 307 cellules sur 263 images.

Ensemble d'audit : 247 cellules sur 10 images.

ACCT vs c-ResUnet vs Ilastik vs Basic Fiji sur le jeu de données Fluocell. ClassifierRandomForest3 et ClassifierBayes3 sont les troisièmes itérations formées d'un modèle Fast Random Forest et BayesNet dans ACCT, respectivement. Les comptages automatiques des trois outils des images Fluocell et l'utilisation de base des outils Fidji sont comparés à notre comptage manuel de l'ensemble de données Fluocell. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne sur les statistiques de performances calculées à partir de chaque image, où la statistique elle-même est calculée à partir du nombre total de cellules dans l'ensemble de données. L'ensemble d'audit est une sélection de 10 images, ce qui est égal à la taille de l'ensemble d'images de validation, choisi parmi l'ensemble de données expérimentales. Les paramètres utilisés sont : un seuil de 0,5, une taille de pixel minimale de 250, une taille de pixel maximale de 5000 et avec l'algorithme de bassin versant appliqué.

ACCT génère automatiquement des courbes ROC pour chaque classificateur formé. Cela permet de visualiser les compromis entre précision et rappel ainsi que le taux de vrais positifs et le taux de faux positifs. La figure 9 montre une courbe ROC du classificateur ACCT 10 appliquée à l'ensemble de données de microglie Iba-1. Le seuil représente la probabilité requise du classificateur pour déterminer si un pixel sera désigné comme pixel de cellule. Les données représentées dans ces graphiques ont été générées à l'aide de la bibliothèque Python scikit-learn qui a effectué une analyse statistique24.

Une courbe ROC générée par ACCT suite à l'étape de validation sur des images de microglie Iba-1. Il représente les taux de faux positifs, de vrais positifs, de rappel et de précision du classificateur 10 à différents seuils de confiance sur les images de microglie colorées Iba-1. Les objets ont été filtrés à une taille minimale de 50 pixels et une taille maximale de 1000 pixels. L'algorithme du bassin versant n'a pas été appliqué à l'ensemble de données Iba-1, en raison d'une séparation cellulaire constante dans les tissus de l'échantillon.

La figure 9 illustre le compromis dans lequel le taux de faux positifs diminue plus rapidement que le taux de vrais positifs lorsqu'un seuil plus élevé est appliqué. Par exemple, l'augmentation du seuil de segmentation des pixels dans l'ensemble de données Iba-1 a réduit le taux de faux positifs par rapport à la valeur par défaut de 0,5. Dans cette étude, le seuil de 0,5 a été utilisé pour les calculs rapportés, car la précision globale n'a pas augmenté en raison d'une diminution des véritables identifications de cellules positives.

L'ACCT est une étape vers des outils de calcul plus accessibles pour le comptage de cellules et la segmentation d'images. Le principal avantage actuel de cette stratégie est le temps plus court nécessaire pour former et appliquer la stratégie de comptage automatique par rapport au comptage manuel de chaque image. Notre étude démontre l'applicabilité générale de cet outil pour explorer rapidement de grandes quantités de données.

Le processus de formation est essentiel pour le succès de cette méthodologie de comptage automatique des cellules et s'appuie sur la connaissance spécifique d'un chercheur de son type de cellule imagée. Chaque ensemble d'images est livré avec son propre ensemble unique de défis en raison de la variabilité des caractéristiques des cellules et des médias, donc fournir des données de formation précises nécessite une compréhension ferme et cohérente des images en question. L'ACCT est en mesure d'aider les utilisateurs à s'adapter à ces fonctionnalités dans leurs images. Les utilisateurs peuvent sélectionner des fonctionnalités spécifiques à analyser dans leurs modèles d'apprentissage automatique sélectionnés pour mieux représenter leurs données d'image. Étant donné que chaque utilisateur dispose de données différentes, cette flexibilité supplémentaire améliore la capacité de l'ACCT à analyser des images spécifiques aux utilisateurs.

Les résultats démontrent que ces ACCT sont les plus performants en termes de précision, ce qui indique que la plupart des cellules « appelées » étaient de vraies cellules. Le rappel a tendance à être nettement inférieur à la précision, ce qui entraîne une diminution des scores F1 et de la précision dans tous les classificateurs ACCT testés sur ces ensembles de données. Cela indique que ces modèles ont tendance à être plus prudents que les comptages manuels d'experts. Cependant, les résultats indiquent que lorsque les modèles classent un objet en tant que cellule, ils ont tendance à être corrects en raison de la haute précision.

De plus, l'analyse de la densité de la microglie sur la Fig. 6 et sur la Fig. 5 démontre que l'ACCT compte les cellules de la même manière que les observateurs experts. Les comptages de tous les observateurs ont identifié une différence moyenne similaire dans la densité de la microglie entre les génotypes expérimentaux. L'ACCT est fortement corrélé aux résultats du comptage des cellules humaines et peut reproduire la différence entre des conditions expérimentales similaires au comptage manuel. Ainsi, c'est un outil utile pour l'analyse d'images entre plusieurs conditions expérimentales.

Nous reconnaissons qu'à l'avenir, des outils de comptage automatique de cellules plus précis sont susceptibles d'évoluer à partir de l'ACCT ou d'autres progiciels. Cependant, ACCT montre actuellement de bonnes performances tout en étant un outil plus accessible aux chercheurs que toutes les approches qui nécessitent de grands réseaux informatiques ou des grappes de calcul. Dans certains cas, l'ACCT surpasse les autres outils de comptage de cellules, mais pas dans tous les ensembles de données. Cependant, les utilisateurs peuvent trouver que l'accessibilité dans l'environnement ImageJ et la vitesse de l'ACCT valent la peine d'être échangées contre la légère perte de performances dans certains ensembles de données d'image.

En termes de puissance de calcul, tous les travaux ont été effectués sur des ordinateurs portables grand public disponibles dans le commerce, tels qu'un Dell Inspiron 15-7559 (publié en février 2017). D'autres outils de comptage automatique de cellules sont souvent conçus pour utiliser de grandes ressources de calcul. Par exemple, Morelli et al. ont utilisé 4 GPU V100 pour traiter leur approche CNN9. Les outils basés sur CNN recommandent d'utiliser un cluster ou un réseau de plusieurs ordinateurs, ce qui permet d'accéder à une plus grande puissance de calcul. Cependant, les clusters d'ordinateurs ne sont pas disponibles pour tous les chercheurs et ils peuvent en outre nécessiter une connaissance des lignes de commande pour une utilisation efficace. L'ACCT n'est pas limité par des spécifications informatiques substantielles, il est en outre plus accessible aux chercheurs moins orientés vers la ligne de commande.

Les résultats reproductibles sont une préoccupation majeure dans la recherche scientifique, et assurer la reproductibilité via le comptage manuel des cellules peut être coûteux et prendre du temps. Étant donné que l'ACCT stocke les classificateurs sous forme de fichiers de modèle unique, ils sont faciles à partager et à télécharger. Ainsi, les chercheurs peuvent partager les résultats reproductibles et l'analyse statistique d'une étude de comptage de cellules en partageant le fichier modèle et l'ensemble des images analysées. Comme les analyses générées par l'ACCT sont stockées sous forme de fichiers modifiables dans Excel, il est facile pour les utilisateurs de partager et de communiquer leurs résultats.

La construction d'ACCT autour de l'interface graphique mise en œuvre par TWS élargit la convivialité en fournissant une infrastructure pour la validation et l'application de classificateurs quantitatifs dans un contexte expérimental complet sur l'appareil de formation flexible et intuitif4. Étant donné que l'ACCT utilise des outils existants pour l'analyse d'imagerie cellulaire tels que TWS, les chercheurs familiarisés avec le programme devraient également apprendre plus facilement à utiliser l'ACCT.

ACCT comprend une documentation accessible, avec un manuel d'instructions qui explique la fonction et l'utilisation du programme, disponible sur sa page GitHub. La documentation est importante pour que les utilisateurs comprennent et apprennent à utiliser les outils logiciels. De nombreux autres outils logiciels documentent les fonctions de leurs composants à l'intérieur de l'outil lui-même, obligeant les utilisateurs à naviguer dans le code pour comprendre et utiliser l'outil. Ceci est évité en ayant des instructions détaillées écrites sur le site Web de l'ACCT qui expliquent l'utilisation de l'outil sans jamais obliger les utilisateurs à accéder manuellement au code lui-même.

L'ACCT pourrait également s'appliquer plus généralement aux problèmes de segmentation d'images. Bien que notre étude se concentre sur le comptage de cellules dans le contexte des neurosciences, tant qu'une image a des caractéristiques d'objet qui peuvent être séparées de son arrière-plan, l'ACCT est capable de quantifier les objets. Cependant, des formes d'objets plus complexes et des arrière-plans moins distinctifs peuvent nécessiter la sélection de modèles plus complexes que ceux démontrés dans cette étude. Nous en donnons un exemple simple dans la Fig. S4 supplémentaire en utilisant le modèle Fast Random Forest, qui est une image segmentée pour les bâtiments par rapport à un champ28. Bien qu'il ne soit pas aussi distinct que les cellules, il démontre que l'ACCT est applicable au-delà du contexte biologique. Dans l'ensemble, l'ACCT devrait considérablement accroître l'accessibilité de l'analyse automatique impliquant le comptage de cellules pour un large public dans la recherche en neurosciences et au-delà.

L'ensemble de données Iba-1, son analyse et l'analyse de l'ensemble de données Fluocell au cours de l'étude en cours sont disponibles dans l'ACCT-Data-Repository, https://github.com/tkataras/ACCT-Data-Repository.git. L'ensemble de données Fluocell analysé est accessible au public tel que publié dans http://amsacta.unibo.it/6706/.

L'ACCT peut être consulté et téléchargé à partir de GitHub à l'adresse https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git.

von Bartheld, CS, Bahney, J. & Herculano-Houzel, S. La recherche du vrai nombre de neurones et de cellules gliales dans le cerveau humain : une revue de 150 ans de comptage cellulaire. J. Comp. Neurol. 524, 3865–3895. https://doi.org/10.1002/cne.24040 (2016).

Article Google Scholar

Jensen, EC Analyse quantitative de la coloration histologique et de la fluorescence à l'aide d'ImageJ. Suis. Assoc. Anat. 296, 378–381. https://doi.org/10.1002/ar.22641 (2013).

Article Google Scholar

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW Nih image to imagej : 25 ans d'analyse d'images. Nat. Méthodes 9, 671–675. https://doi.org/10.1038/nmeth.2089 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arganda-Carreras, I. et al. Segmentation Weka formable : un outil d'apprentissage automatique pour la classification des pixels en microscopie. Bioinformatique 33, 2424–2426. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx180 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Toggas, SM et al. Dommages au système nerveux central produits par l'expression de la protéine d'enveloppe du vih-1 gpl20 chez des souris transgéniques. Nature 367, 188–193. https://doi.org/10.1038/367188a0 (1994).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Lynch, MA Le profil à multiples facettes de la microglie activée. Mol. Neurobiol. 40, 139–156. https://doi.org/10.1007/s12035-009-8077-9 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Karperien, A., Ahammer, H. & Jelinek, H. Quantification des subtilités de la morphologie microgliale avec analyse fractale. Devant. Cellule. Neurosci. 7, 3. https://doi.org/10.3389/fncel.2013.00003 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gomez-Nicola, D. & Perry, VH Dynamique microgliale et rôle dans le cerveau sain et malade : un paradigme de la plasticité fonctionnelle. Le neuroscientifique 21, 169–184. https://doi.org/10.1177/1073858414530512 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morelli, R. et al. Automatisation du comptage cellulaire en microscopie fluorescente grâce à l'apprentissage en profondeur avec c-resunet. Sci. Rép. 11, 1–11. https://doi.org/10.1038/s41598-021-01929-5 (2021).

Article CAS Google Scholar

Clissa, L. et al. Automatisation du comptage cellulaire en microscopie fluorescente grâce à l'apprentissage en profondeur avec c-resunet. AlmaDL http://amsacta.unibo.it/6706/ (2021).

Goecks, J., Nekrutenko, A. & Taylor, J. Galaxy : Une approche globale pour soutenir la recherche informatique accessible, reproductible et transparente dans les sciences de la vie. Génome Biol. 11, 1–13. https://doi.org/10.1186/gb-2010-11-8-r86 (2010).

Article Google Scholar

Berg, S. et al. Ilastik : apprentissage automatique interactif pour l'analyse d'images (bio). Nat. Méthodes 16, 1226–1232. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0582-9 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ronneberger, O., Fischer, P. & Brox, T. U-net : réseaux convolutifs pour la segmentation d'images biomédicales. Dans Conférence internationale sur l'informatique médicale et l'intervention assistée par ordinateur 234–241 (Springer, 2015). https://doi.org/10.1007/978-3-319-24574-4_28.

Diakogiannis, FI, Waldner, F., Caccetta, P. & Wu, C. Resunet-a : Un cadre d'apprentissage en profondeur pour la segmentation sémantique des données de télédétection. ISPRS Journal of Photogrammetry and Remote Sensing 162, 94–114. https://doi.org/10.1016/j.isprsjprs.2020.01.013 (2020).

Annonces d'article Google Scholar

Stirling, DR et al. Cellprofiler 4 : Améliorations de la vitesse, de l'utilité et de la convivialité. BMC Bioinform. 22, 1–11. https://doi.org/10.1186/s12859-021-04344-9 (2021).

Article Google Scholar

Dao, D. et al. Analyste Cellprofiler : Exploration interactive de données, analyse et classification de grands ensembles d'images biologiques. Bioinformatique 32, 3210–3212. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btw390 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh, H. et al. Un rôle central pour le récepteur-1 de l'interféron-\(\alpha\) dans les lésions neuronales induites par le vih-1. J. Neuroinflamm. 17, 226. https://doi.org/10.1186/s12974-020-01894-2 (2020).

Article CAS Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidji : une plate-forme open source pour l'analyse d'images biologiques. Nat. Méthodes 9, 676–682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Virtanen, P. et al. SciPy 1.0 : Algorithmes fondamentaux pour le calcul scientifique en Python. Nat. Méthodes 17, 261–272. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0686-2 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McKinney, W. et al. Structures de données pour le calcul statistique en python. Dans Actes de la 9e conférence Python in Science vol. 445, 51-56 (2010).

Harris, CR et al. Programmation de tableaux avec NumPy. Nature 585, 357–362. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2649-2 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hunter, JD Matplotlib : Un environnement graphique 2D. Calcul. Sci. Ing. 9, 90–95 (2007).

Article Google Scholar

Klein, A. et al. imageio/imageio : v2.16.1. Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6302089(2022).

Pedregosa, F. et al. Scikit-learn : apprentissage automatique en python. J.Mach. Apprendre. Rés. 12, 2825–2830. https://doi.org/10.5555/1953048.2078195 (2011).

Article MathSciNet MATH Google Scholar

Breiman, L. Forêts aléatoires. Mach. Apprendre. 45, 5–32. https://doi.org/10.1023/A:1010933404324 (2001).

Article MATH Google Scholar

Friedman, N., Geiger, D. & Goldszmidt, M. Classificateurs de réseaux bayésiens. Mach. Apprendre. 29, 131–163. https://doi.org/10.1023/A:1007465528199 (1997).

Article MATH Google Scholar

Vincent, L. & Soille, P. Bassins versants dans les espaces numériques : un algorithme efficace basé sur des simulations d'immersion. IEEE Trans. Modèle Anal. Mach. Renseignement. 13, 583–598. https://doi.org/10.1109/34.87344 (1991).

Article Google Scholar

Yan, Q., Zheng, J., Reding, S., Li, S. & Doytchinov, I. Crossloc : Localisation aérienne évolutive assistée par des données synthétiques multimodales. Dans Actes de la conférence IEEE/CVF sur la vision par ordinateur et la reconnaissance de formes 17358–17368, https://doi.org/10.48550/arXiv.2112.09081(2022).

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Les auteurs remercient le Dr Nina Yuan et le Dr Deepika Bhullar pour les images de tissus cérébraux de souris. Ce travail a été soutenu par des fonds du National Institute of Health NIH, R01 MH104131, MH105330, MH087332, DA052209 à MK.

Programme d'études supérieures en génétique, génomique et bioinformatique, Université de Californie, Riverside, Riverside, CA, 92521, États-Unis

Théodore J. Kataras, Tyler J. Jang et Marcus Kaul

École de médecine, Division des sciences biomédicales, Université de Californie, Riverside, Riverside, CA, 92521, États-Unis

Theodore J. Kataras, Tyler J. Jang, Jeffrey Koury, Hina Singh, Dominic Fok et Marcus Kaul

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TK et MK ont conçu ce projet. TJ et TK ont programmé l'outil, effectué l'étude d'analyse d'image et rédigé le manuscrit. JK a participé à l'acquisition d'images. Les tests utilisateurs de l'outil ont été effectués par TK, TJ et DF qui ont fourni des commentaires pendant le développement de l'ACCT. Images de microglie Iba-1 par HS et comptées manuellement par TK, HS et DF. MK a supervisé le projet et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit et approuvé le manuscrit avant sa soumission.

Correspondance à Marcus Kaul.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Kataras, TJ, Jang, TJ, Koury, J. et al. ACCT est un outil de comptage automatique de cellules rapide et accessible utilisant l'apprentissage automatique pour la segmentation d'images 2D. Sci Rep 13, 8213 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34943-w

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Reçu : 09 juin 2022

Accepté : 10 mai 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34943-w

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